Stilling: Evisdom > vitenskap >

Hva er Western Blot Protocol?

Western blot-protokollen er den eksakte standarder som det immunoblot testen er gjennomført. Western blot brukes til å detektere proteiner i en vevsprøve. Prosessen skiller innfødt proteiner ved å bestemme lengder polypeptides bruke en gel elektroforese. Proteinene selv blir så overført til et nitrocellulose membran og analysert av antistoffer.

Den første delen av den vestlige blot protokollen begynner med vev samling. Disse prøvene er samlet fra enten levende vev eller fra en celle kultur. Vev brytes ned og forskjellige hemmere som protease eller fosfatase er innført for å hindre enzymer fra å utføre fordøyelsen. Denne delen av protokollen er vanligvis håndteres i kalde temperaturer for å bevare vevet.

The gel elektroforese prosessen er neste trinn i Western Blot protokollen. I denne delen er det proteiner identifisert av ulike faktorer som molekylvekt eller elektrisk ladning. Denne prosessen er vanligvis avsluttet ved hjelp Polyacrylamide geler med en buffer av natrium dodecyl sulfat. I utgangspunktet blir proteinene negativt ladet og bevege seg mot en positivt ladet elektrode i gel.

Overføring av proteiner er neste del av den samlede Western Blot prosess. En membran er plassert på toppen av gelen, etterfulgt av filter papir. Som en elektrisk strøm administreres er proteiner trukket inn i membranen. Dette omtales som selve "blotting" delen av analysen. Membranene er svært skjøre og lett utsatt for skader.

Den riktige flyten av Western Blot protokollen samtaler for trinn kjent som bindende. For å hindre forurensing av proteiner seg av antistoffer som må til, en slags skjerming må gjennomføres. Den vanligste typen blokkering bruker ikke-fett tørr melk og et vaskemiddel. Dette binder seg til den åpne flekker i membranen og gir klarere resultater når antistoff er lagt.

Detection er neste trinn i henhold til korrekt protokollen. Proteinene er introdusert til antistoffer som har vært knyttet til et bestemt enzym som vil gi forskerne ønsket informasjon. Antistoffet er inkubert med membranen i 30 minutter eller mer. Etterpå er membranen vasket og en sekundær antistoff er innført som binder seg til den første. Ofte en selvlysende agent blir brukt for å hjelpe forskere med identifisering prosessen.

Materialet er vasket på nytt for å fjerne eventuelle ubundet eks. Analyse av størrelsen på den fargede bånd avslører informasjon om primærfaktor og omfanget av et bestemt protein. Dette er vanligvis ferdig et par ganger for å sørge for riktig analyse. Alternativer for påvisning inkluderer røntgen, coloring og kjemikalier.

----------------------------------
Forholde Artikkelen:
----------------------------------